紫外分光光度計在使用測定法測定時，除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長±2nm以內(nèi)測試幾個點的吸收度，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確，除另有規(guī)定外，吸收峰波長應(yīng)在該品種項下規(guī)定的波長±2nm以內(nèi)；否則應(yīng)考慮該試樣的真?zhèn)巍⒓兌纫约皟x器波長的準(zhǔn)確度，并以吸收度大的波長作為測定波長。一般供試品溶液的吸收度讀數(shù)，以在0.3～0.7之間的誤差較小。儀器的狹縫波帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶的半寬度，否則測得的吸收度會偏低；狹縫寬度的選擇，應(yīng)以減小狹縫寬度時供試品的吸收度不再增加為準(zhǔn)，由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸收度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，再計算含量。用作鑒別和檢查項目的方法，分別按各品種項下的方法進行。鑒別項下吸收度讀數(shù)的范圍可根據(jù)配制供試液時的準(zhǔn)確度及制劑的實際含量確定。紫外分光光度計用于含量測定的方法一般有以下幾種。
（1）對照品比較法
按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測成分標(biāo)示量的100±10%，所用溶劑也應(yīng)*一致，在規(guī)定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸收度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度： Cx＝（Ax/Ar）Cr 式中 Cx為供試品溶液的濃度；
Ax為供試品溶液的吸收度；
Cr為對照品溶液的濃度；
Ar為對照品溶液的吸收度。
（2）吸收系數(shù)法按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸收度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計算含量。用本法測定時，應(yīng)注意儀器的校正和檢定。
（3）計算分光光度法采用計算分光光度法應(yīng)慎重。本法有多種，使用時均應(yīng)按各品種項下規(guī)定的方法進行。當(dāng)吸收度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時，影響精度的因素較多，故對照品和供試品測試條件應(yīng)盡可能一致。若測定時不用對照品，如維生素A測定法，則應(yīng)在測定時對紫外分光光度計作仔細(xì)的校正和檢定。紫外分光光度計波長有變動：儀器的校正和檢定由于溫度變化對機械部分的影響，儀器的波長經(jīng)常會略有變動，因此除應(yīng)定期對所用的儀器進行全面校正檢定外，還應(yīng)于測定前校正測定波長。常用汞燈中的較強譜線237.83、253.65、275.28、296.73、313.16、334.15、365.02、404.66、435.83、546.07與576.96nm；或用儀器中氘燈的486.02與656.10nm譜線進行校正；鈥玻璃在279.4、287.5、333.7、360.9、418.5、460.0、484.5、536.2與637.5nm波長處有尖銳吸收峰，也可作波長校正用，但因來源不同會有微小的差別，使用時應(yīng)注意。吸收度的準(zhǔn)確度可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。取在120℃干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約60mg，精密稱定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至1000ml，按下表規(guī)定的波長處測定并計算其吸收系數(shù)。規(guī)定的吸收系數(shù)如下表，相對偏差可在±1%以內(nèi)。
在一定范圍內(nèi)測定：紫外分光光度計對溶劑的要求測定供試品前，應(yīng)先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求；即用1cm石英吸收池盛溶劑，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質(zhì)）測定其吸收度，溶劑和吸收池的吸收度，在220～240nm范圍內(nèi)不得超過0.40；在241～250nm范圍內(nèi)不得超過0.20；在251～300nm范圍內(nèi)不得超過0.10，在300nm以上時不得超過0.05。
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